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摘要：目的:探討富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)蛋白激活DC(樹突細(xì)胞)成熟,并誘導(dǎo)產(chǎn)生CD8~+CTL(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞),進(jìn)行結(jié)腸癌免疫治療并探討其治療效果,為結(jié)直腸癌免疫治療的臨床應(yīng)用探尋新的治療靶點(diǎn)。方法:使用Lgr5蛋白誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)成熟(Lgr5-CD)。隨后使用FACS Calibur/Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表面標(biāo)志物DC80、DC83、DC86以及HLA-DR,酶標(biāo)儀檢測(cè)DC細(xì)胞表面IL-10與IL-12表達(dá)量的變化以檢測(cè)DC細(xì)胞成熟情況。然后通過Lgr5-DC誘導(dǎo)產(chǎn)生Lgr5抗原特異性CD8~+的CTL(Lgr5-DC-CD8~+CTL),并通過磁珠分選試劑盒篩選Lgr5-DC-CD8~+CTL。采用FACS Calibur/Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)Lgr5-DC-CD8~+CTL引起的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29以及正常的人結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD-18C0的凋亡情況,從而驗(yàn)證Lgr5-DC-CD8~+CTL對(duì)結(jié)腸癌HT29腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,同時(shí)探討其對(duì)人結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD-18C0驗(yàn)證其安全性。同時(shí)使用ELISPOT檢測(cè)分別檢測(cè)經(jīng)DC-CD8~+CTL和Lgr5-DC-CD8~+CTL刺激后CCD-18C0與HT29細(xì)胞的γ干擾素(IFN-γ)的釋放量。建立結(jié)腸癌(HT29細(xì)胞)裸鼠模型,探究Lgr5-DC-CD8~+CTL對(duì)ALB/C-nu/nu(HT29細(xì)胞)結(jié)腸癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。最后,采用安樂死法(斷頸法)處死裸鼠,并立即完整剝?nèi)√幩缆闶蟮钠は履[瘤組織,細(xì)胞增殖核抗原(Ki-67)的表達(dá)情況采用免疫組化法檢測(cè),用以反應(yīng)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞增殖情況。同時(shí),血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子抗體(CD31)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),同樣采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)腫瘤微血管密度(MVD),用以反應(yīng)腫瘤微血管生成情況的。此外,通過HE染色,觀察經(jīng)Lgr5-DC-CD8~+CTL治療后腫瘤組織病理變化。結(jié)果:與PBS刺激相比,經(jīng)Lgr5蛋白刺激后的DC細(xì)胞的表面標(biāo)記物DC 80(42.7±2.8%,為PBS組的3.29倍,P<0.05)、DC 83(44.0±2.8%,為PBS組的3.06倍,P<0.05)、DC 86(45.6±2.9%,為PBS組的2.90倍,P<0.05)和HLA-DR(44.2±3.0%,為PBS組的6.93倍,P<0.05)水平顯著上調(diào)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)Lgr5蛋白刺激DC細(xì)胞(Lgr5-DC)組的IL-10(231.6±6.7 pg/ml)水平約為經(jīng)PBS刺激后的DC細(xì)胞組(350.2±7.3pg/ml)的0.66倍(P<0.05),而經(jīng)Lgr5蛋白刺激DC細(xì)胞(Lgr5-DC)組的IL-12(373.5±8.9 pg/ml)水平約為經(jīng)PBS刺激后的DC組(274.6±7.0pg/ml)的1.36倍(P<0.05)。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)的檢測(cè)結(jié)果顯示:正常結(jié)腸上皮細(xì)胞CCD-18C0無論與DC-CD8~+CTL共培養(yǎng)后,還是與Lgr5-DC-CD8~+CTL共培養(yǎng)后,其INF-γ的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)數(shù)量均較為相近,分別為(42.3±2.1點(diǎn)/1×10~5個(gè)細(xì)胞)及(44.1±1.8點(diǎn)/1×10~5個(gè)細(xì)胞)(P>0.05);而結(jié)腸癌細(xì)胞HT29與Lgr5-DC-CD8~+CTL共培養(yǎng)后,其INF-γ的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)數(shù)量(182.5±5.2點(diǎn)/1×10~5個(gè)細(xì)胞)顯著高于結(jié)腸癌細(xì)胞HT29同DC-CD8~+CTL共培養(yǎng)后的的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)數(shù)目(44.0±1.4點(diǎn)/1×10~5個(gè)細(xì)胞)。同時(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29與Lgr5-DC-CD8~+CTL共培養(yǎng)后的INF-γ的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)數(shù)量也同樣顯著高于CCD-18C0與Lgr5-DC-CD8~+CTL共培養(yǎng)后的INF-γ的斑點(diǎn)數(shù)量(44.1±1.8點(diǎn)/1×10~5個(gè)細(xì)胞)(P<0.05)。經(jīng)Lgr5蛋白成功刺激DC細(xì)胞成熟后,其所誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(即Lgr5-DC-CD8~+CTL),與未經(jīng)過Lgr5蛋白刺激DC細(xì)胞成熟所誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(即DC-CD8~+CTL)相比,二者引起的正常結(jié)腸細(xì)胞CCD-18C0的細(xì)胞凋亡率相近,分別為11.8±0.8%及12.0±1.0%(P>0.05);由DC-CD8~+CTL誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的凋亡率為12.4±0.9%,而Lgr5-DC-CD8~+CTL則能夠顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的凋亡,達(dá)到了前者的4.40倍,為54.6±1.7%(P<0.05)。Lgr5-DC-CD8~+CTL所誘導(dǎo)的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的凋亡率(54.6±1.6%)約為其所誘導(dǎo)的正常結(jié)腸CCD-18C0細(xì)胞凋亡率(11.8±0.8%)的4.63倍(P<0.05)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,BALB/C-nu/nu裸鼠結(jié)腸癌移植瘤經(jīng)Lgr5-DC-CD8~+CTL治療后,腫瘤體積增長(zhǎng)顯著低于PBS組和DC-CD8~+CTL組,依次達(dá)到0.25倍和0.24倍(P<0.05)。取得病理組織HE染色后結(jié)果顯示:經(jīng)Lgr5-DC-CD8~+CTL處理的腫瘤組織相較其他各組,出現(xiàn)了比較明顯的水腫、空泡現(xiàn)象,細(xì)胞間隙增大,而腫瘤細(xì)胞核則出現(xiàn)了明顯的固縮現(xiàn)象。在行結(jié)腸癌瘤組織免疫組化探索相關(guān)機(jī)制的試驗(yàn)中我們觀察到,Lgr5-DC-CD8~+CTL組的Ki-67陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)(21.7±7.5%)明顯低于DC-CD8~+CTL組(40.6±4.4%,P<0.05)及PBS組(79.6±6.2%,P<0.05);Lgr5-DC-CD8~+CTL組腫瘤組織中CD31陽性的微血管密度(MVD)(2.1±0.3%)明顯少于DC-CD8~+CTL組(4.2±0.8%,P<0.05)及PBS組(8.7±0.7%,P<0.05);Lgr5-DC-CD8~+CTL組VEGF陽性率(30.7±4.0%)也明顯低于DC-CD8~+CTL組(75.7±3.2%,P<0.01),以及PBS組(80.0±5.0%,P<0.01).以上數(shù)據(jù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:Lgr5蛋白能有效刺激DC細(xì)胞成熟,促使其分泌較多具有抗腫瘤作用的IL12及IFN-γ,而抑制具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用的IL10。經(jīng)過Lgr5蛋白刺激而促進(jìn)成熟的DC細(xì)胞(即Lgr5-DC)能夠很好地誘導(dǎo)產(chǎn)生Lgr5抗原特異性的CD8~+CTL(即Lgr5-DC-CD8~+CTL).而Lgr5-DC-CD8~+CTL能夠很好地抑制并延遲腫瘤組織的生長(zhǎng)。進(jìn)一步探究其機(jī)制結(jié)果顯示其可能與特異性地引起腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及抑制腫瘤組織內(nèi)微血管生成有關(guān),并從而達(dá)到抑制并延遲腫瘤生長(zhǎng)的作用,其或許可作為結(jié)腸癌免疫治療的新靶點(diǎn),并對(duì)結(jié)腸癌免疫治療的臨床應(yīng)用可能具有重要意義。 

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌; 免疫治療; Lgr5; DC; CTL;

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