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第一部分建立缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠心臟模型研究背景:糖尿病顯著增加心血管疾病的發(fā)生率和死亡率,循證醫(yī)學證明,約60%糖尿病患者死于心血管相關(guān)的并發(fā)癥。其中,冠心病是最主要死因,而缺血再灌注損傷在冠心病心肌損害過程中發(fā)揮重要作用。目前,糖尿病容易致冠心病的具體發(fā)病機制不完全清楚。對此,本實驗擬通過糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的模型來探討相關(guān)的發(fā)病機制,探索最佳的治療方案。目的:建立缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠心臟模型。方法:(1)實驗組小鼠高脂飼料喂養(yǎng)2周后,腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素110mg/kg建立糖尿病小鼠模型,對照組小鼠普通飼料喂養(yǎng)并腹腔內(nèi)注射同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。(2)分別于建模前及建模8周時測定實驗組和對照組小鼠感覺神經(jīng)傳導速度,分析糖尿病小鼠神經(jīng)病變情況。(3)利用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)評估缺血再灌注損傷對糖尿病小鼠心功能的影響,記錄心功能的參數(shù)。結(jié)果:(1)實驗組糖尿病小鼠的血糖水平明顯高于對照組(28.81±4.67 vs.8.56±1.64 mmol/L,P<0.01),并維持高水平至實驗結(jié)束。(2)實驗組糖尿病小鼠感覺神經(jīng)傳導速度明顯低于對照組(22.22±3.43 vs.31.29±2.48 m/s,P<0.01),提示糖尿病小鼠出現(xiàn)神經(jīng)性病變。(3)經(jīng)歷缺血再灌注損傷后,糖尿病小鼠的LVSP、±dp/dt、HR、CF均顯著下降,LVEDP升高,與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結(jié)論:成功建立糖尿病小鼠模型,誘導出糖尿病神經(jīng)病變;建立糖尿病小鼠離體心臟Langendorff缺血再灌注損傷模型,為后續(xù)實驗建立研究基礎(chǔ)。第二部分神經(jīng)生長因子對糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究背景:在糖尿病患者中,由于存在神經(jīng)病變,因此即使發(fā)生了嚴重的心肌缺血,疼痛癥狀往往較輕微或不典型,易被誤診或延誤病情。神經(jīng)生長因子(NGF)是一種多肽物質(zhì),能夠維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)的功能。已有研究證實,神經(jīng)生長因子可以改善糖尿病大鼠心臟神經(jīng)功能,降低室性心律失常的發(fā)生率。然而,神經(jīng)生長因子能否改善缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠的心臟功能尚無相關(guān)研究。目的:將NGF轉(zhuǎn)基因療法應(yīng)用于糖尿病合并心肌缺血動物模型,在其改善心臟神經(jīng)末梢功能的同時,觀察缺血心臟的功能改善程度。方法:利用第一部分建立的糖尿病小鼠模型來探索神經(jīng)生長因子對糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的改善程度,具體包括:(1)制備表達小鼠神經(jīng)生長因子的重組腺病毒(Ad-NGF)。(2)Western Blot實驗研究糖尿病小鼠心臟NGF的表達水平。(3)將重組腺病毒(Ad-NGF)轉(zhuǎn)染至心肌組織。(4)建立離體心臟Langendorff灌流體系,觀察Ad-NGF對糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的影響,RM6240生物信號采集系統(tǒng)實時動態(tài)監(jiān)測LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt 和 CF。(5)收集復灌期間的灌流液,測定乳酸脫氫酶(LDH)的含量。結(jié)果:(1)重組腺病毒感染293T細胞后,Western Blot檢測到目的基因融合蛋白的表達,說明重組腺病毒構(gòu)建成功。(2)糖尿病小鼠心肌組織NGF表達顯著減少。轉(zhuǎn)染Ad-NGF后,NGF表達升高,說明目的基因成功轉(zhuǎn)染到心肌細胞并且表達提高。(3)與對照小鼠心臟相比,糖尿病小鼠心臟在缺血再灌注后心功能明顯下降:LVSP、±dp/dt、CF 降低(P<0.05),LVEDP、LDH 升高(P<0.05)。(4)Ad-NGF轉(zhuǎn)染組心臟在缺血再灌注后心功能得到明顯改善,其LVSP、±dp/dt、CF 升高(P<0.05),LVEDP、LDH 降低(P<0.05)。結(jié)論:表達小鼠神經(jīng)生長因子的重組腺病毒可有效轉(zhuǎn)染至心肌組織,發(fā)揮改善糖尿病小鼠離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的作用。第三部分TRPV1途徑在神經(jīng)生長因子介導的糖尿病心肌缺血再灌注損傷的保護機制中的作用研究背景:TRPV1受體是已知的位于感覺神經(jīng)末梢上的感受器,在心臟上有大量表達。已有研究證實,激活TRPV1受體能改善小鼠心肌缺血再灌注損傷后的心功能。然而,NGF能否通過調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)TRPV1受體途徑改善糖尿病心臟缺血再灌注損傷后的心功能尚不清楚。目的:觀察Ad-NGF對糖尿病動物模型心臟感覺神經(jīng)末梢TRPV1受體及其神經(jīng)遞質(zhì)CGRP、SP釋放的影響,并進一步明確NGF能否通過調(diào)節(jié)感覺神經(jīng)TRPV1受體途徑改善糖尿病缺血再灌注損傷后的心功能。方法:(1)Western Blot方法研究糖尿病小鼠心臟組織中TRPV1受體的表達情況,并用ELISA法測定心肌組織中CGRP和SP的含量。(2)將重組腺病毒(Ad-NGF)轉(zhuǎn)染至心肌組織。(3)建立離體心臟Langendorff灌流體系,缺血開始前5分鐘往灌流液中分別加入選擇性CGRP受體拮抗劑CGRP8-37、選擇性SP受體拮抗劑RP67580或選擇性TRPV1受體激動劑CAP,觀察上述物質(zhì)對糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后心功能的影響,以RM6240生物信號采集系統(tǒng)實時動態(tài)監(jiān)測LVSP、LVEDP、HR、±dp/dt 和 CF。(4)收集灌流液,ELISA法檢測灌流液中CGRP和SP的含量。結(jié)果:(1)與非糖尿病組比較,糖尿病組小鼠心肌組織中TRPV1受體表達減少(P<0.05),下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP及SP的含量下降(P<0.05)。(2)與未轉(zhuǎn)染組相比,Ad-NGF轉(zhuǎn)染組糖尿病小鼠心臟TRPV1受體表達增多(P<0.05),下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP的合成和釋放增加(P<0.05),SP的含量無顯著性變化(P>0.05)。(3)離體心臟Langendorff灌流系統(tǒng)加入CGRP8-37處理后,糖尿病小鼠的LVSP、±dp/dt、CF 下降,LVEDP 升高(P<0.05);經(jīng) CAP 處理后,LVSP、±dp/dt、CF升高,LVEDP降低(P<0.05);RP67580除降低CF外,對其他心功能指標無明顯影響。結(jié)論:TRPV1途徑參與NGF介導的心臟保護過程,NGF通過上調(diào)TRPV1受體表達及下游神經(jīng)遞質(zhì)CGRP的釋放來改善糖尿病離體心臟缺血再灌注損傷后的心功能。
2型糖尿病; 感覺神經(jīng)傳導速度; 離體心臟Langendorff灌流; 缺血再灌注損傷; 神經(jīng)生長因子; TRPV1受體; CGRP;
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