客服專線：027-8665 9055
【摘要】研究背景:子癇前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期特有的臨床綜合征,以妊娠20周后出現(xiàn)新發(fā)高血壓和蛋白尿為主要特點,其發(fā)病率約為2-9.4%。PE是發(fā)展中國家產(chǎn)婦死亡和發(fā)病的主要原因之一,但是PE發(fā)生發(fā)展的病理機制尚不清楚。目前,PE發(fā)展進程可分為以下兩個階段:第一階段是胚胎滋養(yǎng)層入侵到母體子宮肌層,導(dǎo)致子宮螺旋動脈重塑不足,從而使胎盤陷入缺血和缺氧環(huán)境,引發(fā)胎盤釋放多種促炎細胞因子和血管生成因子等,引起母體全身炎癥。第二階段,全身炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的母體血管系統(tǒng)的內(nèi)皮功能障礙與腎功能下降引起的血壓升高為此階段的主要特征,最終引起以母體高血壓和蛋白尿為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。緩解母體癥狀的唯一有效途徑是胎盤和胎兒的娩出。既往研究表明,PE患者的胎盤氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡,并且胎盤局部氧化應(yīng)激過度,可誘發(fā)滋養(yǎng)細胞生物學(xué)功能損傷,導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞凋亡增加和侵襲能力下降,引起母親系統(tǒng)性血管內(nèi)皮功能失調(diào)和白細胞激活;而Keap1/Nrf2信號通路則在PE的氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮保護作用,但是其作用機制尚不清楚。因此,深入探討PE的氧化應(yīng)激發(fā)生機制,尋求有效的治療靶點,對緩解PE患者癥狀、延長胎兒在母體時間、降低PE患者死亡率具有重要臨床意義。氧化應(yīng)激(Oxidative Stress,OS)是機體的應(yīng)激反應(yīng),即體內(nèi)的活性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS)及活性氮族(Reactive Nitrogen Species,RNS)產(chǎn)生過多,清除過少,最終導(dǎo)致氧化/抗氧化體系失衡,傾向于氧化,引起組織損傷。與非妊娠狀態(tài)相比,正常妊娠期間母體活性氧生成量量增加。隨著胎盤成熟,血.管形成,胎盤被變成富氧環(huán)境,活性氧的增加刺激妊娠期間抗氧化系統(tǒng)的增強。增強的抗氧化系統(tǒng)有效補償了 OS的氧化作用。與正常妊娠相比,PE患者OS表達增加和抗氧化系統(tǒng)的表達增強,其特征在于活性氧(ROS)在循環(huán)和組織中表達增加。既往研究結(jié)果顯示 Keapl(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1)/Nrf2(nuclear factor-E2-related factor 2)信號通路在抗氧化、抗炎方面扮演了重要的角色。正常狀態(tài)下,細胞質(zhì)中的Nrf2與其負調(diào)控因子Keap1結(jié)合形成Keap1/Nrf2復(fù)合物,大部分Nrf2被Keap1介導(dǎo)的泛素化降解,因此其處于活性相對抑制狀態(tài);而應(yīng)激的狀態(tài)會引起Keap1構(gòu)象的改變,或者由高度活性的氧化物直接促使Nrf2磷酸化,導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離而活化,活化的Nrf2進入細胞核,形成下一步連鎖反應(yīng),從而與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)的結(jié)構(gòu)相結(jié)合,激活下游的多種抗氧化基因。因此Keap1/Nrf2信號調(diào)節(jié)通路在PE的發(fā)病過程中有著重要的作用,研究該機制具有重要臨床意義。目的:1.明確不同分組氧化應(yīng)激水平的變化及Nrf2對于氧化應(yīng)激水平的抑制作用。通過檢測不同分組HTR8/SVneo細胞內(nèi)CAT、GSH-Px、SOD酶活性,進一步明確Nrf2對于氧化應(yīng)激相關(guān)活性酶作用的機制。2.在前期實驗工作基礎(chǔ)上,進一步從細胞水平-臨床水平,采用蛋白印跡雜交、qRT-PCR、siRNA、ELISA等相關(guān)技術(shù)手段的,明確Keap1/Nrf2通路對PE細胞模型中滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo生物學(xué)功能以及PE患者氧化應(yīng)激水平的影響。方法:對于人早孕期絨毛外滋養(yǎng)細胞株HTR8/SVneo進行細胞培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代。通過活性氧及氧化應(yīng)激相關(guān)酶CAT、GSH-Px及SOD酶活性的測定,以明確不同分組HTR8/Svneo及胎盤組織氧化應(yīng)激水平;并通過檢測血漿MMPs預(yù)測子癇前期的發(fā)病風險。應(yīng)用RNAi方法設(shè)計siRNA-Nrf2,對靶基因進行基因沉默實驗,以明確靶基因的功能;應(yīng)用qRT-PCR方法確認Keap1/Nrf2通路與氧化應(yīng)激相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平的差異,Western blot方法確認Keap1/Nrf2通路與氧化應(yīng)激相關(guān)分子蛋白的表達差異。采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)土標準差(Means±SD)表示,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗,多組間的比較用單因素方差分析(one-wayANOVA),P<0.05、P<0.01或P<0.001均為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1.qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染慢病毒后Nrf2mRNA表達結(jié)果示:Si-Nrf2組較Si-NC組Nrf2mRNA的表達量明顯減低(P<0.001);蛋白免疫印跡法檢測Nrf2蛋白的表達量,結(jié)果顯示:Si-Nrf2組較Si-NC組明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。2.HTR8/SVneo細胞H/R組ROS水平與Non-treated組相比明顯升高(p<0.01);對Nrf2進行基因沉默后,Nrf2siRNA+H/R組ROS水平與H/R組相比明顯增高(p<0.01)。3.HTR8/SVneo細胞在缺氧/復(fù)氧條件下,氧化應(yīng)激相關(guān)酶(CAT、GSH-Px、SOD)活性顯著低于處理前,這體現(xiàn)在H/R組氧化應(yīng)激酶水平較正常對照組明顯降低(P<0.001)。SiRNA+H/R 組 HTR8/SVneo 細胞內(nèi) CAT、GSH-Px、SOD 活性下降顯著(P<0.01)。4.缺氧復(fù)氧后HTR8/SVneo細胞Keap1 mRNA表達輕度低于正常對照(P<0.05);HTR8/SVneo細胞缺氧復(fù)氧后Nrf2 mRNA表達明顯高于正常對照組(P<0.001);HTR8/SVneo細胞缺氧復(fù)氧后HO-1 mRNA表達水平明顯高于正常細胞(P<0.001)。5.HTR8/SVneo細胞缺氧復(fù)氧后Keap1蛋白表達水平明顯低于正常對照組（P<0.05);而缺氧復(fù)氧后HTR8/SVneo細胞Nrf2蛋白表達水平明顯于正常細胞(P<0.001);HO-1蛋白表達水平在缺氧復(fù)氧后也明顯高于正常細胞(P<0.001)。6.正常孕婦和重度子癇前期患者的孕周、收縮壓、舒張壓以及新生兒體重均存在統(tǒng)計學(xué)差異。7.孕中期PE患者的MMP-2水平高于正常參與者。但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另一方面,PE患者MMP-9血漿水平略低于正常懷孕組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。比較MMP-2/MMP-9比率,發(fā)現(xiàn)PE組的比率明顯高于正常妊娠組,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。MMP-2用于預(yù)測PE的ROC曲線下面積僅為0.563,95%置信區(qū)間(CI)為 0.497-0.629(P>0.05)。而 MMP-9 的預(yù)測 PE 的 ROC 曲線下面積為 0.587,95%CI為0.522-0.652,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ROC曲線下使用MMP-2/MMP-9比率預(yù)測PE的曲線下面積為0.841,95%CI為0.797-0.886(P<0.001)。8.重度子癇前期患者胎盤組織CAT(P<0.001)、GSH-Px(P<0.01)、SOD(P<0.01)酶活性均低于正常胎盤組織。9.重度子癇前期患者胎盤組織Keap1 mRNA表達水平稍低于與正常胎盤組織(P<0.05);重度子癇前期患者胎盤組織Nrf2mRNA表達水平明顯高于與正常胎盤組織(P<0.001);重度子癇前期患者胎盤組織HO-1mRNA表達水平明顯高于與正常胎盤組織(P<0.001)。10.重度子癇前期患者胎盤組織Keap1蛋白表達水平稍低于與正常胎盤組織(P<0.05);重度子癇前期患者胎盤組織Nrf2蛋白表達水平明顯高于與正常胎盤組織(P<0.01);重度子癇前期患者胎盤組織HO-1蛋白表達水平明顯高于與正常胎盤組織(P<0.01)。結(jié)論:本研究通過檢測不同類型HTR8/SVneo細胞內(nèi)活性氧、CAT、GSH-Px、SOD酶活性,進一步明確氧化應(yīng)激時活性氧水平上升、其相關(guān)酶活性下降及Nrf2對于氧化應(yīng)激相關(guān)活性酶作用的機制;在mRNA及蛋白水平,Keap1/Nrf2信號通路在缺氧復(fù)氧狀態(tài)下表達水平明顯改變,提示可通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2信號通路抑制氧化應(yīng)激的水平。孕中期患者血漿MMPs水平對子癇前期有重要的預(yù)測意義。不同樣本的氧化應(yīng)激相關(guān)活性酶因臨床狀態(tài)不同而有明顯差異;重度子癇前期患者胎盤組織Nrf2,HO-1 mRNA及蛋白表達水平明顯高于與正常胎盤組織,而Keap1低于正常,提示Keap1/Nrf2信號通路在重度子癇前期患者表達水平發(fā)生明顯變化,所以調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2信號通路可減緩子癇前期的發(fā)病。 還原
關(guān)鍵詞：Keap1/Nrf2信號通路; 子癇前期; 滋養(yǎng)細胞;
兔抗H0-1抗體?兔抗Keap丨抗體?兔抗Nrf2抗體?HRP標記兔抗小鼠IgG 武漢默沙克生物科技有限公司
