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HE染色
1．取材
切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以6mm×6mm×5mm為宜。
注意事項：
（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。
（2）切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進行選，盡可能不要損傷所需要的部分。
2．固定
將切好的組織用生理鹽水組織洗3次，立即投入10%中性福爾馬林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小時。
注意事項：
（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。
（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1-2次新液。
（4）材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。
脫鈣72小時中間不換液是樣本30倍 武漢默沙克（進口脫鈣液）
鑷子觸質(zhì)粒由硬變韌性為準(zhǔn)。
3. 洗滌
材料經(jīng)固定后,PBS或雙蒸水沖洗約3小時。（20，30，30，60）
4. 脫水
材料依次經(jīng)80%、90%、100%、100%各級乙醇溶液脫水，各30min
注意事項：
（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。
（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。
（3）在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。
（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。
（5）如需過夜，應(yīng)停留在80%酒精中。
（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象
5．透明（環(huán)保透明脫蠟液）武漢默沙克
純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明為止）。
由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。
透明注意事項
（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。
（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。
（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。
6．透蠟
放入二甲苯和石蠟各半的混合液60min，再放入石蠟Ⅰ60分鐘、石蠟Ⅱ透蠟30分鐘。
透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織大小而定。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進行，并保持箱內(nèi)溫度在55-60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5h。
透蠟注意事項
（1）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；
（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，力求在最短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。
7. 包埋
包埋時，用鑷子夾取石蠟?zāi)Ｗ樱ń饘儋|(zhì)地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。再將鑷子稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)Ｖ?，排列整齊。再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。
8. 切片
①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。
②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。
③搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。
④調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。
⑤調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4-10微米。
⑥一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40-50r/min。
⑦切成的蠟帶到20-750px長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。
⑧用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。
⑨切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。
9. 展片、貼片
打開水浴鍋，使水溫維持在40-45℃，另準(zhǔn)備30%乙醇溶液。
② 切片時，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。
② 用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。（可?。?
③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。
④ 另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽，放于切片架上。
10. 脫蠟復(fù)水
將溫箱溫度調(diào)至65℃，待溫度控制在60℃時，將切片連同切片架放入干燥的溫箱內(nèi)3-5小時至蠟熔化。
之后，石蠟切片經(jīng)脫蠟透明Ⅰ、Ⅱ脫蠟各20min，勿動（防治組織掉）此步為關(guān)鍵步，請輕拿輕放。然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各5min
11． 染色
切片放入蘇木精中染色約10-30min。
染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當(dāng)縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當(dāng)延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。
12．水洗
用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可），但要注意流水不能過大，以防切片脫落。
13．分化
將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數(shù)十秒鐘。見切片變紅，顏色較淺即可。
14．漂洗
切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍色。
15．脫水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各5min。
16、復(fù)染
用0.5%伊紅乙醇液對比染色1-3min。
伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應(yīng)淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。
17．脫水Ⅱ
將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。
18．透明
切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5min。
二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。
19．封藏：中性樹膠封存
因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。
封藏的方法：
封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。
染色結(jié)果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。
