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研究目的
在中醫(yī)理論指導(dǎo)下， 研究活血降糖飲對２ 型糖尿病模型大鼠的糖脂代謝、胰島素抵抗和腸道菌群穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用及具體機制； 通過對活血降糖飲主要活性化學(xué)成分的檢測分析， 并進(jìn)一步探討其對２ 型糖尿病大鼠的糖脂代謝和胰島素抵抗的影響； 此外，通過“HPLC-MS”及藥效驗證” 建立活血降糖飲（ 凍干粉） 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)以確保多次研究結(jié)果的可重復(fù)性。
材料和方法
本研究主要包括活血降糖飲對２ 型糖尿病大鼠的糖脂代謝、胰島素抵抗和腸道菌群穩(wěn)態(tài)的作用及其機制研究和活血降糖飲質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究。
１ 、SPF級雄性的Wistar大鼠52只，7周齡，體重150±20ｇ，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，按照體重隨機分為正常組和造模組，正常組大鼠10只，其余造模組， 正常組大鼠給予普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料（D12492，60％脂肪）喂養(yǎng)。在４周末禁食不禁水１２小時后給予造模組大鼠腹腔注射２％鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（35ｍg/kg）（溶解于PＨ＝4.4的無菌檸檬酸鈉緩沖液），正常組大鼠注射等體積的0.1mol/L檸檬酸緩沖液。分別在注射STZ3d、7d 、14d采用血糖儀測定大鼠的空腹血糖（大鼠禁食１２小時）。造模組大鼠空腹血糖在11.1--33.3 ｍmol／Ｌ之間， 且在14d后相對穩(wěn)定的大鼠被認(rèn)為造模成功，納入研究；將造模組大鼠按體重和空腹血糖隨機分為５組（ｎ＝10）：模型對照組（Ｍｏｄ）、二甲雙胍組（Ｍet）、活血降糖飲低劑量組（HXJTL）、活血降糖飲高劑量組（HXJTL）。另設(shè)正常對照組（Norn＝10只）。正常和模型對照組的大鼠給予雙蒸水灌胃， 劑量為５ml／kg b.ｗ；二甲雙狐組大鼠給予二甲雙胍（90mg／kg）；活血降糖飲低劑量組給予活血降糖飲凍干粉1.25ｇ／kg，活血降糖飲高劑量組給予活血降糖飲凍干粉５g／kg。每日灌胃給藥一次， 連續(xù)給藥8周。
２ 、每日觀察記錄大鼠的狀態(tài)和更換墊料， 每周記錄大鼠體重一次， 每３ 天記錄一次攝水?dāng)z食量。每周釆用經(jīng)割尾法采集大鼠尾部靜脈血， 用羅氏血糖儀測量空腹血糖（ 禁食１ ２ 小時） 并記錄； 在給藥８ 周末， 所有大鼠禁食不禁水１ ２ 小時后， 進(jìn)行口服糖耐量試驗（ OGTT ） ， 給予2g／kg 葡萄糖溶液灌胃，分別在0、30 、60、120分用血糖儀用血糖儀測尾靜脈血糖。
３ 、分別在給Ｓ ＴＺ 造模前時間點（-4w ）、STZ 造模后給藥干預(yù)治療前（0w） 、給藥治療８ 周結(jié)束前（8w） 采集大鼠腸道糞便， 釆用TIANamp Stool DNA kit 試劑盒提取腸道糞便中的腸道菌群基因組DNA，使用Illumina Miseq 基因測序平臺對腸道糞便中所有微生物的16s rRNA 的V4區(qū)域進(jìn)行DNA測序， 并進(jìn)行相關(guān)分析腸道菌群物種的豐度和多樣性。
４ 、藥物干預(yù)結(jié)束后， 采集大鼠血液和摘取大鼠胰腺、肝臟、骨骼肌、腎臟等組織； 酶標(biāo)法檢測大鼠的血脂譜（TG、TC 、LDL-ｃ、HDL- c） 水平、血清肌酐、尿素氮、SOD 、MDA ， 以及糖原合成酶、己糖激酶等活性酶水平；ELISA 發(fā)檢測大鼠的空腹胰島素、血清瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α 等； 采用蒽酮法檢測肝臟的肝糖原、骨骼肌的肌糖原、血清游離脂肪酸等； Ｈ Ｅ 染色和免疫組化染色檢測胰腺組織的病理變化； TUNEL法檢測胰腺組織胰島細(xì)胞的凋亡； Western blot 法檢測肝臟組織Ｐ-ACC 、Ｐ-AKT蛋白和骨骼肌PI3K 、AKT、Ｐ-ACC 、GLUT4 蛋白的表達(dá)。Western blot法檢測胰腺組織相關(guān)凋亡蛋白。
５ 、通過ＨPLC-ＭS方法測定活血降糖飲中主要活性成分， 將含量最高的兩個活性成分（ 梓醇和羥基紅花黃色素Ａ）也通過對2型糖尿病大鼠進(jìn)行驗證實驗， 具體方法同前。
６ 、此外， 采用2015年版的《中藥藥典》規(guī)定作為中藥成分質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)， 以HPLC法檢測不同加工提取工藝制備的活血降糖飲藥液成分， 優(yōu)化活血降糖的提取工藝。在優(yōu)化加工工藝的基礎(chǔ)上， 通過中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫挖掘出活血降糖飲中所具有的已知活性成分， 然后結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中存在的最可能具有代謝調(diào)控作用的主要活性成分， 篩選出22種主要活性成分； 采用HPLC-MS 的方法對這22個主要活性成分進(jìn)行檢測作質(zhì)量控制， 并將這一標(biāo)準(zhǔn)制備成的活血降糖飲（ 凍干粉） 在T2DM 模型大鼠上進(jìn)行藥效預(yù)驗證， 最后將這一驗證顯效的中藥復(fù)方一系列制備工藝標(biāo)準(zhǔn)作為活血降糖飲研究用藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
研究結(jié)果
１ 、高脂飼料喂養(yǎng)4周加小劑量（35 mg／kg）— 次性腹腔注射建立的２型糖尿病大鼠與人類２型糖尿病類似， 都存在明顯的胰島素抵抗、多飲多尿和血脂代謝紊亂等；造模成功率超過90％ ， 且模型組的大鼠全程空腹血糖趨于平穩(wěn)； 活血降糖飲可以顯著降低２ 型糖尿病大鼠的能量和水的攝入， 盡管沒有對體重產(chǎn)生過大的影響； 在干預(yù)８周后， 低劑量和高劑量的活血降糖飲組的空腹血糖分別下降54.83％和56.16％ ， 顯著高于模型組（Ｐ＜0.0５ ） ； 給藥組的OGTT 曲線下面積也顯著低于模型組（Ｐ<0.01） ，但是高劑量組沒有明顯優(yōu)于低劑量組。
２ 、在給藥治療８ 周后， 活血降糖飲給藥組的大鼠胰島素抵抗指數(shù)和胰島ｐ 細(xì)胞功能均得到明顯改善（Ｐ＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較， 活血降糖飲組的血脂水平（TG 、TC、LDL-ｃ）均有顯著下降（ P＜0.05） ， 血清肌酐水平也有明顯下降（ Ｐ＜0.01）， 而對HDL-c、AST、ALT、BUN等沒有明顯影響。
３ 、活血降糖飲能改善T2DM大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)， 與模型組比較， 活血降糖飲組的血清SOD活性水平明顯提高，MDA水平、TNF-α 游離脂肪酸水平等顯著下降（ Ｐ＜0.05 ） ?；钛堤秋嬁梢愿纳芓2DM大鼠的瘦素抵抗， 血清瘦素水平顯著下降， 脂聯(lián)素明顯上升（ Ｐ<0.05）； 同時， 與模型組比較， 活血降糖飲還可以升高肝糖原、肌糖原、糖原合成酶和己糖激酶等的含量（ Ｐ＜0.05 ） 。
４ 、HE染色、免疫組化染色和TUNEL 法凋亡檢測結(jié)果顯示， 活血降糖飲對胰腺具有較好的保護(hù)作用。它能維持驕傲的β細(xì)胞形態(tài)， 增加胰島細(xì)胞數(shù)量， 上調(diào)insulin的表達(dá)， 抑制β細(xì)胞凋亡等；Western blot結(jié)果顯示， 活血降糖飲能上調(diào)肝臟和骨骼肌組織的P-ACC、AKT（ P-akt） 蛋白表達(dá)（ Ｐ<0.05） ， 上調(diào)骨骼肌PI3K 和GLUT４蛋白的表達(dá)（ Ｐ<0.05 ） 此外， 與模型組比較， 經(jīng)過活血降糖飲或二甲雙胍治療后， 胰腺組織的促凋亡蛋白BAX 、Caspase-3表達(dá)下調(diào)（P＜0.00１ ）， 而抑凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)則明顯上調(diào)（P＜0.00ｌ ） 。
５ 、腸道菌群基因組測序結(jié)果顯示， 與正常對照組比較， 模型組的大鼠腸道菌群豐度和多樣性降低， 致病菌種類和數(shù)目增加， 表現(xiàn)為明顯的腸道穩(wěn)態(tài)失衡； 活血降糖飲可以顯著增加Lactobacillaceae、Lachnospiraceae等有益菌的種類和數(shù)目， 而降低如Prevotellaceae和Porphyromon adaceae等致病菌種類； 相關(guān)性分析顯示， 活血降糖飲調(diào)控的腸道菌群與空腹血糖、血脂和胰島素抵抗顯著相關(guān)，KEGG分析也顯示， 這些被調(diào)控的腸道菌群主要涉及的是糖脂代謝通路。
６ 、活血降糖飲中兩個主要活性成分也具有明顯改善２2型糖尿的大鼠的糖脂代謝作用， 與模型組比較， 梓醇和羥基紅花黃色素Ａ 均可以明顯降低T2DM大鼠的空腹血糖、血脂水平和胰島素抵抗指數(shù)（P＜0.05） 。
７ 、此外， 優(yōu)化了活血降糖飲藥液的提取制備工藝， 通過數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索篩選出活血降糖飲可能具有代謝性調(diào)控作用的22個主要活性成分， 制備的活血降糖飲凍干粉具有對2型糖尿病大鼠糖脂代謝調(diào)節(jié)作用， 該制備加工工藝和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)可以作為活血降糖飲質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)， 可以確保研究結(jié)果的可重復(fù)性。
結(jié)論：
１ 、通過HFD喂養(yǎng)加STZ注射的方法可以建立與人類疾病相似且穩(wěn)定的T2DM大鼠模型； 活血降糖飲能夠明顯改善T2DM大鼠的攝食攝水及多飲多尿癥狀， 降低空腹血糖和血脂水平， 改善胰島素和瘦素抵抗； 同時， 還可以改善內(nèi)毒素血癥所致的癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)， 維持胰島細(xì)胞形態(tài)， 抑制胰島β細(xì)胞凋亡， 并促進(jìn)胰島素的分泌。
２ 、活血降糖飲治療Ｔ ２ Ｄ Ｍ 的潛在機制可能是升高肝糖原、肌糖原、糖原合酶和己糖激酶的含量， 改善炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)， 改善胰島素抵抗與PI3K／AKT 信號通路和提高骨骼肌GLUT4 表達(dá)， 調(diào)控胰腺組織相關(guān)凋亡蛋白（BAX、Caspase-3和BCL-2） 。
３ 、通過HFD喂養(yǎng)加STZ注射的方法建立的T2DM大鼠模型的腸道菌群穩(wěn)態(tài)明顯失衡， 活血降糖飲可以顯著改善Ｔ２ Ｄ Ｍ 大鼠的腸道菌群紊亂狀態(tài)， 主要表現(xiàn)在減少了如Prevotellaceae等致病菌的數(shù)量， 增加如乳酸桿菌（Lactobacillaceae） 等有益菌的數(shù)量， 整體調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成； 藥物菌群Marker與糖脂代謝的生化指標(biāo)等疾病特征呈負(fù)相關(guān)， 這些有益桿菌與丁酸鹽產(chǎn)生密切相關(guān)， 其可能是通過提高的SCFAs等代謝產(chǎn)物， 可能參與T2DM糖脂代謝和胰島素抵抗相關(guān)信號通路的調(diào)控作用來發(fā)揮T2DM的治療作用.
４ 、活血降糖飲主要有效活性成分梓醇和羥基紅花黃色素Ａ ，T2DM 大鼠干預(yù)實驗也證實均具有明顯改善糖脂代謝和胰島素抵抗的作用； 但是中藥活性單體的作用是否與復(fù)方一樣在人體身上取得類似的治療效果仍有待進(jìn)一步的研究。同時， 這也為中藥復(fù)方的整體和拆方研究提供了一個思路。
５ 、通過對活血降糖飲主要的活性成分控制來建立活血降糖飲的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是可行的， 通過不同的實驗驗證結(jié)果顯示幾乎一致的藥效作用。這也為中藥復(fù)方的可重復(fù)研究思路提供了很好的借鑒。
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